.RU

«Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»


На правах рукописи


Шилько

Татьяна Александровна


Патогенетические факторы модуляции апоптоза

мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких


14.00.16 – патологическая физиология

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук


Томск – 2009


Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:


доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН Новицкий Вячеслав Викторович


доктор медицинских наук, профессор Уразова Ольга Ивановна


Официальные оппоненты:


доктор медицинских наук, профессор Агафонов Владимир Иванович


доктор медицинских наук Потапов Алексей Валерьевич


доктор медицинских наук, профессор Салмина Алла Борисовна


Ведущая организация:

Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи


Защита состоится «____»________________2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН


Автореферат разослан «_____»_____________2009 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Амосова Е.Н.


^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туберкулез остается серьезной и актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой [Краснов В.А., 2008; Jeong Y.J., Lee K.S., 2008]. Изучение эпидемиологической ситуации за последние годы показало, что прогноз относительно ликвидации туберкулеза не оправдался. Данные Европейского регионального бюро ВОЗ свидетельствуют о том, что распространение туберкулеза приобрело угрожающие масштабы. Так, например, в России заболеваемость туберкулезом в 2007 г. достигала 83,2 случаев на 100 тыс. населения, а в Томской области в 2007 г. – 102,5, в 2008 г. – 101,4. Серьезную эпидемиологическую проблему представляют группы риска – лица с асоциальным поведением, иммигранты, наркоманы, дезадаптированные подростки, среди которых имеют широкое распространение лекарственно-устойчивые формы туберкулеза, включая полирезистентные варианты инфекции. Прогрессирующее увеличение числа случаев заражения антибиотико-рефрактерными штаммами микобактерий, устойчивых к двум, трем и более туберкулостатическим препаратам, является отрицательной тенденцией последних лет. Об этом свидетельствует рост частоты развития остропрогрессирующих форм лекарственно-резистентного туберкулеза с тяжелым клиническим течением и значительной распространенностью патологического процесса [Каминская Г. О. и соавт., 2006; Исакова Ж.Т. и соавт., 2007; Маркелов Ю.М., Дородная И.А., 2007; Фирсова В.А. и соавт., 2007] .

Согласно современным представлениям, наиболее тяжелое течение туберкулеза отмечается при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа [Масленников А.А. и соавт., 2007]. Ведущая роль в обеспечении противотуберкулезной защиты организма, как известно, принадлежит тканевым и циркулирующим фагоцитам – альвеолярным макрофагам, моноцитам и полиморфно-ядерным нейтрофилам, а также индукторам иммунного воспаления – лимфоцитам. Между тем, наиболее характерными признаками дизрегуляции иммунных процессов при туберкулезе, по данным ряда авторов, являются, прежде всего, нарушения структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитов и моноцитов [Комогорова С.Э. и соавт., 2005; Пичугин А.В., 2005; Фирсова В.А. и соавт., 2007].

Установлено, что патогенез иммунной гипо- и анергии при инфекционном процессе во многом обусловливается индуцированной возбудителем дезорганизацией хромосомного аппарата иммунокомпетентных клеток и систем, обеспечивающих генетический гомеостаз макроорганизма. Основную функцию гомеостатической регуляции в организме выполняют система ДНК-репарации, обеспечивающая внутриклеточное восстановление генетических структур, и апоптоз, обусловливающий поддержание баланса между делением и гибелью клеток и элиминацию аберрантных клеточных форм и инфицированных клеток. В то же время показано, что цитогенетические повреждения и дисфункция ДНК-репаративной системы могут служить своего рода индукторами апоптоза [Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006; Camenisch U., Naegeli H., 2009].

Выяснение путей запуска и молекулярных механизмов дизрегуляции запрограммированной гибели отдельных клеток в многоклеточном организме является одной из нерешенных задач медико-биологических наук. Актуальность этой проблемы определяется тем, что срыв (угнетение или, наоборот, усиление) апоптозной программы в организме обусловливает развитие и прогрессирование ряда заболеваний, в том числе инфекционных. Так, например, установлено, что дефект Fas-индуцированного апоптоза моноцитов/макрофагов и стимуляция экспрессии на макрофагальных клетках антиапоптозного гена bcl-2 при туберкулезе являются ключевыми факторами латентной микобактериальной инфекции [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa T., 2007, 2008]. Вместе с тем, многие вопросы относительно дизрегуляторных нарушений естественной гибели клеток и участия апоптоза в патогенезе иммунной дестабилизации при туберкулезном процессе остаются открытыми. До сих пор нет патогенетического обоснования роли перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и ионного дисбаланса в реализации апоптозных потенций иммуноцитов и формировании бактериальной иммунорезистентности при туберкулезе.

В свете изложенного представляется важным изучение молекулярно-биологических механизмов, определяющих развитие и характер течения туберкулезного процесса. Это, несомненно, расширит имеющиеся фундаментальные представления о патогенезе туберкулезной инфекции и, возможно, послужит основой для создания более совершенных методов диагностики и прогнозирования туберкулеза, выявления групп риска по развитию тяжелых прогрессирующих форм заболевания, а также для разработки более эффективных методов профилактики и коррекции иммунопатологических изменений, сопровождающих туберкулез и противотуберкулезные мероприятия.

^ Цель исследования: выявить общие закономерности и факторы модуляции апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови при лекарственно-чувствительном и лекарственно-резистентном туберкулезе легких до и в условиях противотуберкулезной химиотерапии.

^ Задачи исследования:

  1. Оценить уровень апоптоза мононуклеаров периферической крови у больных 18-55 лет с распространенным деструктивным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких (инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией).

  2. Оценить роль нарушений макро- и микроэлементного состава, цитогенетического статуса, структурных свойств мембраны, перекисного окисления липидов в индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких.

  3. Провести сравнительную оценку апоптоз-модулирующих факторов мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных легочным туберкулезом (лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией) и у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких.

  4. Установить патогенетические факторы индукции апоптоза мононуклеаров периферической крови при отдельных клинических формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких до и в процессе противотуберкулезной полихимиотерапии.

^ Научная новизна. Проведена комплексная оценка апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных с различными клиническими формами (инфильтративный, диссеминированный, фиброзно-кавернозный, казеозная пневмония) распространенного деструктивного туберкулеза легких в связи с чувствительностью возбудителя к терапии до начала лечения и на фоне проведения противотуберкулезной химиотерапии. Установлено, что течение распространенного деструктивного лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких сопровождается активацией спонтанного и Н2О2-индуцированного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови, уровень которого после курса интенсивной противотуберкулезной терапии становится еще выше, а после курса поддерживающей химиотерапии проявляет тенденцию к нормализации. При этом уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов наиболее значителен при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного (в лимфоцитах) и лекарственно-резистентного (в моноцитах) туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии имеет наименее выраженный характер. Охарактеризована роль нарушений цитогенетического статуса, структурной организации мембраны и макро- и микроэлементного состава (Ca2+, Na+, Fe2+, Mg2+, Al3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+) клеток и плазмы в модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких до и на фоне противотуберкулезной терапии. Установлены дифференциальные факторы индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови. Наиболее значимыми из них при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких оказались увеличение числа предуготовленных к апоптозу СD95+-клеток, хромосомные аберрации на фоне подавления ДНК-репарации (как фактор апоптоза лимфоцитов), повышение текучести мембраны и изменения макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы (как фактор апоптоза моноцитов); при лекарственно-резистентном туберкулезе легких – нарушения липидного спектра мембраны и катионного состава внутриклеточной среды и плазмы. По результатам исследования сделано предположение о том, что апоптоз мононуклеарных лейкоцитов крови может быть реализован по Fas-опосредованному, а также (в связи с накоплением в клетках кальция) митохондриальному и церамид-опосредованому механизмам. Показано, что спектр факторов активации апоптоза при туберкулезе легких существенно отличается от такового при хронической обструктивной болезни легких; при этом перекисное окисление липидов опосредует повышенный уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких и не оказывает апоптогенный эффект при множественной лекарственной резистентности. Установлено, что на фоне специфической противотуберкулезной терапии спектр апоптоз-стимулирующих факторов варьирует, выраженность составляющих его изменений (равно как и непосредственно уровень активации апоптоза) возрастает после интенсивного курса лечения, в то время как после завершения фазы поддерживающей терапии уровень гибели клеток проявляет тенденцию к нормализации.

^ Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют существующие фундаментальные знания о роли апоптоза в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, факторах активации программированной гибели лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных туберкулезом легких. Результаты исследования могут служить основой новых методологических подходов к иммунокоррекции, направленной на повышение жизнеспособности и регуляцию численности клеток крови, формирующих реакции доиммунного воспаления (моноциты) и адаптивного противотуберкулезного иммунитета (лимфоциты), а также быть использованы в качестве информативных критериев для оценки прогнозирования течения и исхода заболевания. Это позволит проводить своевременную профилактику осложнений легочного туберкулеза, в том числе вызванных иммунотоксическим действием применяемых в терапии туберкулеза фармакологических средств.

^ Положения, выносимые на защиту:

  1. Течение туберкулеза легких сопровождается активацией апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови. Степень выраженности и спектр факторов индукции программированной гибели клеток зависят от клинической формы заболевания. При этом они наиболее значительны при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-резистентного туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии являются минимальными.

  2. К общим факторам индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких относятся повышенное содержание холестерина и фасфатидилинозитола в клеточной мембране в сочетании с уменьшением микровязкости ее липидного бислоя, а также увеличение внутриклеточной концентрации Ca2+, Al3+ и (при снижении содержания в плазме) Mg2+, Cu2+. При этом степень активности апоптоза моноцитарных клеток в связи со стимуляцией эксцизионной ДНК-репарации ниже, чем уровень программированной гибели лимфоцитов.

  3. При лекарственно-чувствительном туберкулезе, наряду с активацией перекисного окисления липидов, в структуре апоптогенных факторов лимфоцитов превалируют гиперэкспрессия CD95/Fas на фоне повышения количества хромосомных аберраций и подавления ДНК-репарации в клетках, а в числе факторов апоптоза моноцитов – повышение текучести мембраны и изменения внутриклеточной и плазменной концентрации макро- (Na+, Mg2+) и микроэлементов (Al3+, Cu2+). При лекарственно-резистентном туберкулезе апоптоз лимфоцитов и моноцитов индуцируют нарушения липидного спектра мембраны (увеличение концентрации холестерина и легкоокисляемых фракций липидов) и катионного (Fe2+, Na+, Mg2+, Cu2+) состава клеток и плазмы крови.

  4. К факторам модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, отличающим специфическую (туберкулез) и неспецифическую (хроническая обструктивная болезнь) патологию легких, относятся сопровождающие течение туберкулезного воспаления хромосомные аберрации (обмены, разрывы), изменения активности ДНК-репарации (подавление в лимфоцитах и стимуляция в моноцитах), катионного состава и повышение содержания холестерина в мембране клеток.

  5. В условиях интенсивной противотуберкулезной терапии усиление апоптоза мононуклеарных лейкоцитов обусловлено более выраженными (чем до лечения) перестройками их клеточной мембраны, повышением активности перекисного окисления липидов, а также (в направлении гибели лимфоцитов) числа хромосомных аберраций и концентрации макро- и микроэлементов (Fe2+, Al3+, Cu2+, Mg2+ в клетках и Ca2+, Na+ в клетках и плазме). При этом после курса поддерживающей химиотерапии восстановление активности процессов липопероксидации и ДНК-репарации, структуры и катионного состава клеток и плазмы определяет тенденцию к нормализации апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

^ Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию противотуберкулезной службы Томской области, 75-летию кафедры фтизиатрии и пульмонологии СибГМУ «Проблемы туберкулеза и современные пути их решения» (Томск, 2004), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2004), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2005), VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), XIII Российском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Второй международной Германо-Российской конференции Форума им. Коха и Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007), Internationaler Kongress Fachmesse: moderne aspekte der prophylaxe, behandlung und rehabilitation (Ганновер, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2003-2009).

Результаты исследования используются в курсе лекций по патологической физиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови», «Воспаление») и фтизиатрии (раздел «Иммунитет и аллергия при туберкулезе») на лечебном и педиатрическом факультетах ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Исследования проведены при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям РФ (ГК №02.445.11.7419 «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы»; ГК №02.412.11.2040 «Молекулярные основы персонализированной терапии социально-значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма») и Совета по грантам при Президенте РФ (НШ-1051.2003.04 «Молекулярные механизмы нарушений структуры, метаболизма и функций клеток крови при патологии»; НШ-4153.2006.7 «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы»).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 29 работ, из них 12 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

^ Объем и структура работы. Диссертация изложена на 366 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 96 таблицами. Библиографический указатель включает 382 источника, из них 225 отечественных и 157 зарубежных авторов.


^ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованы 298 больных с распространенным деструктивным туберкулезом легких. Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной противотуберкулезной больнице (гл. врач – Янова Г.В.) во фтизиотерапевтических отделениях №1 (зав. отд. – Новосельцева О.И.), №2 (зав. отд. – Малиновская Т.З.), №3 (зав. отд. – Янов А.А.). На завершающем этапе лечения больные наблюдались на базе Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач – Мишустин С.П.).

Клинический осмотр и обследование пациентов, сбор анамнеза, постановку диагноза и назначение соответствующих схем лечения осуществляли врачи-фтизиатры Томской областной туберкулезной клинической больницы (чл.-корр. РАМН, профессор Стрелис А.К., к.м.н. Янова Г.В., к.м.н. Филинюк О.В., к.м.н. Лещев А.С., к.м.н. Петрова Л.Е., Мельникова Т.И., Янов А.А., Щегерцов Д.А.). Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких. Диагноз инфильтративного туберкулеза легких был выставлен 117 (39,26%) больным, диссеминированного – 103 (34,56%), фиброзно-кавернозного – 61 (20,47%), казеозной пневмонии – 17 (5,71 %).

В ходе исследования все больные с туберкулезом легких были разделены на две основные группы в зависимости от чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам: в первую группу вошли 188 больных, выделяющих M. tuberculosis, чувствительные к основным противотуберкулезным препаратам, во вторую – 110 больных, выделяющих M. tuberculosis с первичной множественной лекарственной устойчивостью (устойчивость к изониазиду, рифампицину и стрептомицину). Каждая группа дополнительно была разделена на подгруппы в зависимости от клинической формы заболевания. Для видовой идентификации и определения чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (методом абсолютных концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Лечение больных туберкулезом легких проводилось в соответствии со стандартными схемами противотуберкулезной химиотерапии, включающими в себя интенсивную и поддерживающую фазы лечения.

Обследование больных туберкулезом легких проводили до начала специфической противотуберкулезной терапии, после окончания курса интенсивной химиотерапии и после курса поддерживающей противотуберкулезной терапии.

Группы сравнения составили 17 здоровых мужчин и женщин в возрасте от 18 до 50 лет и 17 пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Все лица, входящие в группу здоровых доноров, прошли медицинский осмотр в МЛПМУ «Поликлиника №5» (главный врач – Коваленко С.И.). В анамнезе не было обнаружено хронических инфекционных заболеваний, аллергических реакций. Частота заболеваемости острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями не превышала 3 раз в год.

Материалом исследования служила венозная кровь.

Определение общего количества лейкоцитов, абсолютного и относительного числа их отдельных морфологических форм проводили общепринятыми гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987].

Выделение лимфоцитов и моноцитов периферической крови осуществляли на градиентах плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3 и 1,083 г/см3 соответственно) [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в счетной камере Горяева с использованием 0,5% трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].

Определение апоптотических лимфоцитов и моноцитов проводили методом люминесцентной фотометрии на основе индикации annexin V+ клеток («BD Biosciences», США). Апоптоз стимулировали путем добавления в клеточную суспензию Н2О2 с последующим культивированием клеток в течение 24 ч. Оценку экспрессии Fas/APO-1 (CD95+) на лимфоцитах периферической крови проводили методом иммунофлуоресценции с использованием набора моноклональных антител «Клоноспектр» (МедБиоСпектр, Россия).

Активность УФО-индуцированной ДНК-репарации в лимфоцитах и моноцитах исследовали методом сцинтилляционной радиометрии. Обработку культур лимфоцитов крови и приготовление препаратов для хромосомного анализа лимфоцитов проводили по методу P.S. Moorhead et al. [1960]. Для стимуляции клеточного деления использовали 0,01% раствор колхицина («Fluka», Швейцария). У каждого обследуемого анализировали не менее 100 метафазных пластинок, учитывая общее количество клеток с хромосомными нарушениями, количество аберраций хромосом (на клетку), количество клеток с изменением числа и нарушениями структуры хромосом.

Концентрацию железа, меди, марганца, цинка, магния, алюминия в лимфоцитах, моноцитах и плазме крови определяли методом эмиссионного спектрального анализа по спектру излучения атомов, а концентрацию натрия, калия и натрия – плазменно-фотометрическим методом, основанным на измерении интенсивности излучения атомов элементов, возбуждаемых в пламени [Кузяков Ю.Я. и соавт., 1990].

Оценку микровязкостных свойств плазматической мембраны мононуклеарных лейкоцитарных клеток крови осуществляли путем флуоресцентного зондирования с использованием флуоресцентного зонда пирен [Добрецов Г.Е., 1989]. Выделение плазматических мембран мононуклеарных лейкоцитов проводили путем разделения клеточных компартментов в двухфазной системе декстран (500 000)-ПЭГ 6000 [Финдлей Дж., Эванс С., 1991]. Изучение липидного спектра мембран мононуклеарных лейкоцитов периферической крови осуществляли поэтапно с использованием метода тонкослойной хроматографии: выделение липидного экстракта [Folch J et al., 1957]; определение содержания общих фосфолипидов [Колб В.Г., 1982]; разделение основных классов фосфолипидов и нейтральных липидов [Жухоров Л.С., 1984]; определение процентного содержания фракций липидов; количественное определение фосфолипидов [Жухоров Л.С., 1984]; количественное определение холестерина [Карпищенко А.И, 2002]. Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием соответствующих стандартов фирмы «Sigma» (США).

Исследование содержания ТБК-активных продуктов [Арутян А.В. и соавт., 2000] и диеновых конъюгатов [Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983] в мононуклеарах периферической крови проводили методом спектральной фотометрии. Активность супероксиддисмутазы (адренохромовый методод) и каталазы (по убыли перекиси водорода) в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови определяли спектрофотометрически [Арутян А.В. и соавт., 2000].

sochinenie-iosifa-flaviya-o-drevnosti-evrejskogo-naroda-stranica-9.html
sochinenie-izvestnij-lingvist-g-stepanov-utverzhdal-slovar-yazika-svidetelstvuet-o.html
sochinenie-kosheeva-andriana-stranica-2.html
sochinenie-kto-vladeet-informaciej-tot-vladeet-mirom.html
sochinenie-makiavelli-kasayusheesya-nauki-ob-obraze-gosudarstvennogo-pravleniya-po-otnosheniyu-k-nravoucheniyu-obladaet-tem-zhe-samim-svojstvom-chto-i-sochinenie-spinozi-svyazannoe-s-rassuzhdeniem-ob-ispovedanii-veri.html
sochinenie-moj-pushkin.html
  • thesis.bystrickaya.ru/primernaya-tematika-kontroliruemoj-samostoyatelnoj-raboti-po-medicinskoj-psihologii.html
  • uchitel.bystrickaya.ru/proshanie-s-laskovoj-dumoj-gazeta-pavlikova-olga-19112007-216-str-2-grizlov-b-v-monitoring-smi-17-19.html
  • shpargalka.bystrickaya.ru/vnimanie-dannij-spisok-umenshen-stranica-4.html
  • shpargalka.bystrickaya.ru/vivodi-funkcionalnie-i-esteticheskie-aspekti-diagnostiki-i-rekonstruktivnogo-hirurgicheskogo-lecheniya-svezhih-travm.html
  • reading.bystrickaya.ru/metodicheskie-ukazaniya-dlya-studentov-1-kursa-zaochnogo-obucheniya-stranica-4.html
  • thesis.bystrickaya.ru/posle-bessonnoj-nochi-provedennoj-u-kojki-tyazhelogo-bolnogo-operirovannogo-mnoyu-ya-vozvrashalsya-domoj-dishalos-legko-svobodno-i-hot-solnce-eshe-ne-vzoshlo-pr-stranica-29.html
  • otsenki.bystrickaya.ru/rukovoditel-uchebnogo-zavedeniya-konkursa-moj-minsk.html
  • grade.bystrickaya.ru/mnozhestva-i-operacii-nad-nimi-stranica-3.html
  • uchenik.bystrickaya.ru/59-plan-grafik-meropriyatij-s-detmi-podgotovitelnih-grupp-po-podgotovke-k-shkole.html
  • thesis.bystrickaya.ru/preemnik-chukotki-gazeta-nadezhda-petrova-07072008-124-str-5.html
  • paragraph.bystrickaya.ru/language-foreign-first-second-to-speak-a-to-learn-a-success-tematicheskoe-planirovanie-klass.html
  • kolledzh.bystrickaya.ru/6-oboznachenie-izdelij-i-konstruktorskih-dokumentov-polozhenie-o-diplomnom-proektirovanii-v-dvuh-chastyah-razrabotano.html
  • credit.bystrickaya.ru/pervie-predposilki-dlya-poyavleniya-v-rossii-psihoterapii-kak-lichnostno-i-kliniko-orientirovannoj-oblasti-medicini-mezhdisciplinarnogo-haraktera-nachali-skladivat-stranica-51.html
  • desk.bystrickaya.ru/plan-i-vvedenie-2-ii-osnovnaya-chast-franciya-v-sisteme-mirovih-hozyajstvennih-svyazej-prirodoresursnij-potencial-i-ego-ocenka.html
  • university.bystrickaya.ru/federalnaya-celevaya-programma-stranica-18.html
  • textbook.bystrickaya.ru/identifikaciya-lichnosti-pri-issledovanii-obektov-biologicheskogo-proishozhdeniya-i-problema-dostovernosti-dannih.html
  • literatura.bystrickaya.ru/ria-novosti-gosudarstvennie-vuzi-rossii-monitoring-prozrachnosti-dlya-abiturientov-vipusk-2-rejtingovie-spiski-stranica-9.html
  • nauka.bystrickaya.ru/v-dvuh-estestvah-bez-smesheniya-bez-izmeneniya-bez-razdeleniya-bez-razobsheniya-vi-svoboda-voli-i-sudba-organizacii-19.html
  • institut.bystrickaya.ru/tajnata-istoriya-na-choveshkata-civilizaciya-skrateno-izdanie-na-zabranenata-arheologiya-majkl-a-kremo-richard-l-tompsn-stranica-6.html
  • occupation.bystrickaya.ru/metodicheskoe-posobie-proizvedeniya-aleksandra-dyuma-tri-mushketyora-dvadcat-let-spustya-vikont-de-brazhelon-na-urokah-izo-v-7-8-klassah-7-klass-maj.html
  • exam.bystrickaya.ru/vliyanie-samoocenki-na-uspeshnost-obucheniya-v-mladshem-shkolnom-vozraste-chast-5.html
  • control.bystrickaya.ru/bileti-po-teorii-gosudarstva-i-prava-100-chast-14.html
  • education.bystrickaya.ru/15-klassifikaciya-ais-informacionnie-tehnologii-upravleniya.html
  • thesis.bystrickaya.ru/prilozhenie-3-kurs-lekcij-uchebnoe-posobie-dlya-uchashihsya-9-11-klassov-i-studentov-visshih-uchebnih-zavedenij-annotaciya.html
  • occupation.bystrickaya.ru/nalogovie-lgoti-dlya-nauchnih-issledovanij-i-innovacionnoj-deyatelnosti.html
  • lesson.bystrickaya.ru/sovremennik-antologiya-lyubvi.html
  • predmet.bystrickaya.ru/severo-zapadnij-federalnij-okrug-k-konkursnoj-dokumentacii.html
  • notebook.bystrickaya.ru/hasankommunenergo.html
  • prepodavatel.bystrickaya.ru/tematicheskij-plan-disciplini-aktivnij-turizm.html
  • notebook.bystrickaya.ru/ishite-testi-ne-tolko-po-nazvaniyam-no-i-po-soderzhaniyu-ishite-voprosi-iz-nuzhnogo-testa-vashi-metodisti-chasto-nepravilno-nazivayut-fajli-s-testami.html
  • desk.bystrickaya.ru/pasport-programmi-razvitiya-municipalnogo-obsheobrazovatelnogo-uchrezhdeniya-srednego-polnogo-obshego-obrazovaniya.html
  • shkola.bystrickaya.ru/osnovi-sovremennogo-anglijskogo-yazika-speckurs-po-analizu-hudozhestvennogo-teksta-2.html
  • shpargalka.bystrickaya.ru/upravlenie-obrazovaniya-administracii-pervomajskogo-rajona.html
  • lektsiya.bystrickaya.ru/poyasnitelnaya-zapiska-neobhodimost-sozdaniya-adaptirovannoj-programmi-po-russkomu-yaziku-dlya-uchashihsya-8-9-klassov-obsheobrazovatelnih-uchebnih-zavedenij-s-ukrainskim.html
  • school.bystrickaya.ru/internet-resursi-boris-grizlov-monitoring-smi-10-12.html
  • © bystrickaya.ru
    Мобильный рефератник - для мобильных людей.